中华医学会检验医学分会,北京整合医学学会血栓与止血分会
常规血浆凝固实验在各医疗机构广泛开展,为出凝血疾病诊断治疗提供最基本的信息。临床实践中,血凝学检测的质量保证相对其他实验较为复杂,因此存在问题也较多。本共识组织国内出凝血领域的检验及临床专家,综合国内外研究、标准和指南,分别针对常规血浆凝固实验检验前、检验中、检验后各环节提出推荐意见。本共识适用于指导和规范临床检验操作,以保证实验质量达到相关行业标准,是对行业标准实施条件的有益补充及说明。本文涉及的实验项目包括活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、国际标准化比值(international normalized ratio,INR)、凝血酶时间(thrombin time,TT)、纤维蛋白原。
文中的建议等级,按照重要程度分级,文中“应、必须”的建议是国内外文献和专家推荐必须执行。“宜”的建议指虽然不一定执行,但是执行操作对质量有益。“可、可以、推荐”的建议是各单位根据自身情况可以进行的操作。 “不应、不可、禁止”的建议指对质量有负面影响的操作,不能执行。
正确的实验前准备是保证检验结果准确、可靠的前提,尤其是检验检测技术和方法高度自动化的今天,临床医生反馈的不满意检查结果原因分析有30%~75%可溯源至实验前,因此应重视实验前因素对检验结果可能产生的重要影响。
共识1:结果分析时应综合考虑患者生理状况、生活习惯及用药情况对血浆凝固实验结果的可能影响。
患者的生理情况如年龄、性别、肥胖、饮食、生理状态和血型等,生活习惯如吸烟、饮酒,用药情况如服用抗血小板药物、抗凝药、中药等都可能影响检验结果。由于肝脏发育相对较晚,所以新生儿的凝血因子水平较低,处于生理性低凝期,在6个月时婴儿大多数凝血因子水平可达成人水平。当年龄超过50岁后,纤维蛋白原和凝血因子(F)Ⅷ随着年龄的增长而增加,FⅡ和FⅤ随着年龄先增加后降低,FⅩ随着年龄的增长而降低,相应的凝血筛查实验随着年龄变化可能产生改变。女性的FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ、FⅪ和FⅫ水平高于男性。女性在月经、妊娠、绝经等不同状态下,凝血功能表现不一,如FⅧ和血小板功能在月经期和卵泡早期处于最低水平,妊娠期女性由于高凝状态会出现PT、APTT缩短,而纤维蛋白原水平和D-二聚体水平增加。肥胖可导致促凝因子活性增加、纤溶功能减弱、抗凝血酶和蛋白C活性升高。富含维生素K的食物对华法林有反作用,可导致INR下降。O型血个体由于血管性血友病因子(vWF)更快清除而使vWF水平降低,未与vWF结合的FⅧ可以很快被降解,从而导致FⅧ的半衰期较短,故vWF和FⅧ活性常低于非O型血人群。吸烟可造成FⅦ抗原和活性升高。饮酒能抑制血小板功能。阿司匹林、华法林、肝素等可影响血小板功能和凝血功能。一些脂糖肽类抗菌药(如替拉万星)也可能通过与检测试剂——磷脂的结合而干扰凝血分析。
共识2:在标本采集时要根据采血量、患者年龄、静脉粗细程度选用适宜型号的针头;采集多管血液标本时,应遵循正确的采血顺序依次采集。
推荐采用含有抗凝剂的真空采血装置。出凝血标本的采血针头一般为19G或21G,婴幼儿用22G或23G,过大或过小的针头易引起溶血。如果使用注射器,需要使用小容量的注射器(≤20 mL),推荐的材质为塑料或硅化玻璃。止血带使用时间不宜超过1 min,即使特殊情况需要,国际血液学标准化协会(International Council for Standardisation in Haematology,ICSH)也强调止血带最长使用时间不应超过2 min。不应反复拍打穿刺部位和反复穿刺。ICSH提出需同时采集多个类型的标本时,应遵循血培养管、枸橼酸钠抗凝管、血清管、肝素管、EDTA抗凝管、其他管的顺序。而如果无血培养管,且非通过蝴蝶针或留置导管采集血液,采集标本也不用于血小板功能研究时,可不丢弃采集的第一管枸橼酸钠抗凝血液标本。血液进入试管后,轻柔颠倒混匀3~4次,确保抗凝剂与血液充分混匀。
共识3:血浆凝固实验抗凝剂应使用109 mmol/L(3.2%)枸橼酸三钠的水合物(Na3C6H5O7·2H2O)。
进行常规血浆凝固实验的标本建议使用浓度为109 mmol/L,3.2%(3.2 g/100 mL)枸橼酸三钠的水合物(Na3C6H5O7·2H2O)抗凝,不应使用其他抗凝剂(如草酸盐、肝素或EDTA)。ICSH不建议使用129 mmol/L(3.8%)枸橼酸钠采集血液标本,主要是考虑到国际敏感指数(International Sensitivity Index,ISI)容易受到枸橼酸钠抗凝强度的影响,129 mmol/L枸橼酸钠抗凝的标本中测定的INR可比结果正确值高20%。血液与枸橼酸钠抗凝剂的体积比为9∶1。采集标本量不够时会降低该比例,可能导致检测结果假性延长;而采集标本量过多时会增加该比例,可能引起样本凝固、检测结果不正确,采集量偏离应小于10%~20%,具体偏离限值可由实验室自行验证而确定。必要时以注射器采血,拔掉采血针头及试管盖后,沿试管内壁缓缓注入,立即加盖轻柔颠倒混匀3~4次以上。
血细胞比容(heamatocrit, HCT)≥0.55时,应对患者血液中枸橼酸盐的终浓度进行调节。推荐按照公式进行调节:
X=(100-HCT×100)×标本量/(595-HCT×100)
式中:X——每毫升血液标本所需的抗凝剂体积数;标本量的单位为mL;HCT——血细胞比容,单位为%。
注:对于血细胞比容≤0.20的,目前尚无足够数据用以确定枸橼酸盐浓度的调节。
共识4:分离血浆时,要在规定的速度和时间条件下离心,以得到乏血小板血浆(血小板计数<10×109/L)。
进行常规血浆凝固实验的标本均需要使用乏血小板血浆进行检测,推荐在室温下以1 500×g的离心力离心不少于15 min。应使用水平式转子离心机,以减少血浆和血小板的重新混合。离心时不应使用紧急制动,不可加大转速减少离心时间。离心结束后,离心桶应轻拿轻放,防止血小板重新被混悬。除乏血小板外,还应保证红细胞不被离心破坏,否则破坏的红细胞会释放出某些活性物质而干扰检测。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)建议,不同项目对离心后血浆中残留的血小板要求不同,PT和 APTT要求血浆中血小板计数<200×109/L即可,而某些特殊的项目,如蛋白S、狼疮抗凝物等,要求血小板计数必须<10×109/L,为保证检测质量,这些项目往往需要二次离心。离心条件的改变必须经过严格的实验室验证。
共识5:检验前标本应保持试管盖封闭,保存时间依检测项目、保存温度而确定。
用于PT测定的未离心或离心后未分离血浆的标本,保存在18~24 ℃条件下未开盖的试管中,推荐在标本采集后24 h内测定。保存在2~4 ℃条件下,可能会造成FⅦ的冷激活从而改变PT的结果。
检测未使用肝素患者的APTT标本时,未分离血浆的标本(未离心或离心)在未开盖的试管中,保存在18~24 ℃条件下,推荐在标本采集后4 h内测定。
含有普通肝素(低分子量肝素)的标本用于APTT测定时,保存在18~24 ℃条件下,推荐在标本采集后1 h内离心,推荐在标本采集后4 h内进行血浆测定。
无法立即检测的标本应低温保存,如用于PT测定的标本在24 h内、用于APTT和其他项目测定的标本在4 h内无法完成测定时,推荐分离血浆并将其冰冻保存。在-20 ℃条件下,推荐最多保存2周;在-70 ℃条件下,推荐最多保存6个月。
共识6:冰冻血浆标本检测前置于37 ℃水浴中迅速融化,轻轻混匀后立即测定。
融化后的标本如不能即刻测定,推荐置于4 ℃条件下暂存,并于2 h内完成测定。当检测地点距离标本采集和离心地点较远时,血浆应在标本采集后2 h内分离,在标本采集后4 h内测定。如果不能在规定时间内运输到达目的地,推荐分离血浆并将其冰冻保存。在-20 ℃条件下,推荐最多保存2周;在-70 ℃条件下,推荐最多保存6个月。禁止使用自动除霜冰箱冻存标本。
随着各种指南、规范、室间质量评价等的应用和普及,实验中因素已经获得了越来越广泛的重视,但仍有部分重要细节容易被操作人员忽视,最终对检验结果产生重要影响。
共识7:建议使用Ⅰ级水进行血浆凝固实验。
商业化纯水无需检查电阻、微生物数量等。实验室水机装机时需检查水质,应定期进行水压、电导率、电阻率和微生物培养等检测,确保符合要求。如试剂需手工溶解,需严格按照说明书要求操作,应固定专用加样枪或纯水储存容器,操作时防止交叉污染;如试剂为仪器自动复溶,则严格按照说明书要求操作。
共识8:需手工复溶的试剂从冰箱取出后,宜恢复至室温后再缓慢打开橡胶塞,确保试剂粉末不溢洒于瓶外。
干粉试剂加入指定体积的复溶剂后迅速盖上橡胶塞,轻柔颠倒混匀试剂瓶至试剂充分溶解,避免产生气泡。试剂配制完成并于室温静置20~30 min后,方可用于检测。应避免试剂瓶口长时间敞开导致干粉潮化产生凝块。不同试剂溶解方法和静置时间需按相应试剂说明书要求。对于仪器自动复溶的试剂,按仪器操作规范进行。
共识9:溶解后的试剂需注意有效期,应在有效期内使用。
每种试剂在溶解后的稳定性和保存温度可能稍有差异,具体推荐参考说明书。试剂在不用于项目检测时,推荐将试剂瓶盖封闭,且放置于2~8 ℃条件下保存。如试剂为闭盖穿刺,且仪器试剂仓冷藏温度可达到8 ℃以下,可直接将试剂置于仪器试剂仓,保存至有效期截止或试剂用尽。
共识10:建议充分考虑分析仪器因素对血浆凝固实验结果的影响。
仪器因素主要包括加样系统、温控系统、检测系统故障。加样针、试剂针或管路有气泡,针外壁污染,堵针,标本或试剂的注射器单元故障,混匀功能减弱,孵育时间和激活时间不正确,温度异常,试剂飞溅污染,电磁干扰等,可造成样本检测结果重复性差、结果不准确。因此,应严格按照说明书操作仪器,严格执行仪器的日常维护、保养与校准[17]。
共识11:从冰箱取出的质控品需恢复至室温后再溶解,且需注意不同保存条件下的稳定期。
质控品恢复至室温后,缓慢打开橡胶塞,沿瓶内壁缓缓加入指定体积的实验用水,迅速盖上橡胶塞。轻轻摇晃使瓶壁周围和瓶盖上的干粉物溶解,溶解后将质控品静置于室温15~25 min后使用。未溶解的质控品在2~8 ℃条件下,可稳定至有效期。
溶解后的质控品在18~24 ℃条件下未开盖的试剂瓶中,可稳定4~6 h。溶解后的质控品在-20 ℃条件下未开盖的试剂瓶中,可稳定4周。不同质控品的储存方法和稳定时间可能不同,推荐参考其说明书的详细描述。另外,为避免质控品的反复冻融,在溶解后可小量分装,冻存于-20 ℃。冰冻质控品推荐在37 ℃水浴中迅速融化,轻轻混匀后使用。冻融后的质控品在18~24 ℃条件下未开盖的试剂瓶中,可稳定2 h。
共识12:每日至少进行一次室内质控,24 h运行的仪器推荐每8 h做一次质控检测。
室内质控应至少使用2个水平。除常规质控外,当更换新的试剂批号、更换新的校正曲线、更换相同批号但不同瓶试剂、仪器有任何波动等,应及时进行质控检测。可以使用第三方质控品或试剂盒配套的质控品。
共识13:推荐应用相应质控物至少检测10 d,至少使用20个检测结果的均值作为质控图的中心线。
在更换新的试剂批号或仪器进行重要部件的维修后,应重新确定质控物的均值。推荐使用Levey-Jennings质量控制图监测每日质控情况。推荐至少采用13s规则和22s规则判断是否失控。
共识14:INR必须进行校准。
INR是应用患者血浆与正常对照血浆的PT比值和所用试剂的ISI值计算而得,以使不同的凝血活酶试剂测得的结果具有可比性。必须使用试剂盒提供的与本实验室凝血仪型号所对应的ISI值、本实验室MNPT(mean normal prothrombin time,MNPT)(选取至少20人份,男女比例近似1∶1)而计算INR。推荐建立实验室本地ISI值。具体方法为:用水平1到水平6的INR赋值标准血浆(不同系统的定值不一样),使用本实验室的凝血活酶/联合试剂测定其PT值,将所得的结果和血浆INR赋值绘成对数图,曲线斜率的倒数为ISI值,曲线在Y轴的截距为MNPT值,在曲线上读取患者的INR值。也可以使用厂家试剂盒提供的条码直接录入INR校准曲线;或者手工输入MNPT和ISI值至仪器中,获得正确INR计算公式。
试剂批号更换时必须重新确定本批次ISI值、MNPT,并进行参考区间和INR报告一致性(凝血仪报告的INR和根据公式计算的INR)验证。
共识15:了解本实验室所用试剂的主要成分,以便异常结果的分析。
不同种类APTT试剂中磷脂和激活剂的成分存在差异,其对肝素、凝血因子和狼疮抗凝物的敏感性也可能不同。
TT检测试剂中凝血酶对标本的活化可能存在一定差异,其稳定性差,试剂失效时间较短。纤维蛋白原(Clauss法)检测试剂是通过凝血酶激活纤维蛋白原来进行检测,其对异常纤维蛋白原血症的检出能力也存在差异,建议结合PT演算法得到的纤维蛋白原结果综合分析。
实验后因素主要涉及检验报告的形成和发布、检验标本的保存处理以及检验结果解释3个方面。实验室应在排除影响因素后结合患者临床诊断、用药情况等综合分析形成报告并发送给临床和患者。医院信息系统(HIS)和实验室信息系统(LIS)的互通有助于报告审核人员了解患者的临床表现、临床用药、相关病史以及患者其他实验室检查结果,是保证检验结果质量的重要助力。检测完毕后的标本根据标本类型和检测目的可做必要时间的备查性保留。
血浆凝固实验的质量保证涉及到实验前、实验中和实验后3个方面,充分考虑各个过程中的影响因素并对其进行全面质量控制和质量管理,以保证检验结果的可靠性,使其助力于患者的正确诊断和治疗。
执笔:吴俊(北京积水潭医院),章文洁(北京积水潭医院),曲林琳(吉林大学第一医院),周静(四川大学华西医院),刘超男(四川大学华西医院)
专家组成员(按姓氏汉语拼音排序):戴菁(上海交通大学医学院附属瑞金医院);胡晓波(上海市临床检验中心);李传保(北京医院);李强(南方医科大学南方医院;刘超男(四川大学华西医院);乔蕊(北京大学第三医院);干岭(中华检验医学杂志社);曲林琳(吉林大学第一医院);唐宁(华中科技大学同济医学院附属同济医院);王学锋(上海交通大学医学院附属瑞金医院);吴俊(北京积水潭医院);伍柏青(江西省人民医院);许俊堂(北京大学人民医院);张磊(西安交通大学第二附属医院);张真路(武汉亚洲心脏病医院);张洋(中国医学科学院阜外医院);周厚清(中国医学科学院阜外医院深圳医院);周静(四川大学华西医院);郑磊(南方医科大学南方医院);周洲(中国医学科学院阜外医院)。